PCR.qPCR.dPCR.RTPCR.RTqPCR分不清？
PCR、qPCR、dPCR、RT – PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR；傻傻分不清？
自从PCR技术被浪出来：PCR传奇史：“浪”出来的生物技术，经历了飞速的发展和技术更新，新冠的洗礼，让所有人都了解到了“核酸检测”的技术。
然而，对于初学者来说，PCR技术的名称和原理往往令人感到困惑，傻傻分不清。某个小伙伴尝试给让你搞懂PCR、qPCR、dPCR、RT - PCR 、RT-qPCR、Real-Time PCR之间的区别和联系。
如果你已经完全分清了，建议继续：多重PCR——病原体检测体系设计原则
1. 普通PCR(就是只做核酸的扩增哦！！！)
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），即一代PCR，是1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Kary Banks Mulis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。其原理类似于DNA的天然复制过程，在体外条件下以指数级速度扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析。PCR由变性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Extension）三个基本反应步骤构成：
①变性：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成为单链。这一步骤通常在94℃至95℃的高温下进行，持续30秒至1分钟，确保双链DNA完全解离。
②退火（复性）：当温度降低时，引物与模板DNA中互补的区域结合成杂交分子。退火温度通常低于引物本身的变性温度，一般在50℃至65℃之间，持续30秒至1分钟，确保引物与模板DNA特异性结合。；
③延伸（Extension）：在DNA聚合酶、dNTPs（四种脱氧核糖核苷三磷酸）和Mg2+等存在下，DNA聚合酶催化引物按照5′→3′方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。延伸温度通常在70℃至75℃之间，持续时间根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度而定。
图1 PCR的基本反应原理
如果想用于核酸的检测，其实还需要进行凝胶电泳的辅助。所以很多人认为的第一代PCR，其实更应该像是凝胶电泳技术，而不是PCR技术本身！！！
经过演化和革新，PCR技术已经发展了三代：普通PCR技术（PCR+凝胶电泳）、实时荧光定量PCR技术（qPCR）以及数字PCR（dPCR）技术。
第一代PCR主要缺点：容易发生非特异性扩增和假阳性结果；检测耗时长，操作繁琐；
只能做定性检测。目前，在临床检测中普通PCR已经成为测序等检测技术的前处理方法，没有太多的独立应用空间。在食品药品等检测和分型中，还是不少国家标准的检测技术（毕竟标准的变革不宜那么频繁！！！要加把劲了，跟上新技术。）
2.实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）
实时荧光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团，在整个PCR过程中通过收集荧光信号实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，最后通过标准曲线和CT值对待测样品进行定量分析。qPCR常用的有两种方法：SYBR Green法和TaqMan探针法。
①荧光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是荧光定量PCR中最常用的荧光染料，它能与所有的双链DNA结合。在PCR反应体系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就会在过程中与双链DNA结合，从而产生荧光信号。因此，反应中发出的全部荧光信号就会与反应中双链DNA的量呈正比，荧光强度也会随着产物的增加而增加。但是由于染料与双链DNA是非特异性结合，如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确，因此可能产生假阳性的结果。
优点：价格相对较低；使用方便；检测灵敏度高。
缺点：检测特异性较低，可能产生假阳性结果；无法进行多重PCR检测。
图2 荧光染料法的工作原理
②荧光探针法（TaqMan技术）：TaqMan探针是最早用于定量的方法，也是临床检测中最常用的检测方法。PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针是一个寡核苷酸，5'端标记一个荧光报告基团（Reporter, R），3'端标记一个淬灭基团（Quencher, Q）。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，以至于无法检测到荧光信号；而当PCR扩增时（在延伸阶段），探针会被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，报告基团发射底的荧光不会再被吸收，从而可以在荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA，就形成一个荧光分子，PCR产物的形成与荧光分子的形成完全同步，PCR产物越多，荧光信号累积的越多，荧光强度越大。
优点：检测特异性强；灵敏度高；适合进行多重qPCR检测。
缺点：需要根据不同的模板序列，合成不同的探针；靶序列浓度极低或存在大量非特异性扩增时，无法准确定量。
图3 荧光探针法的工作原理
3. 逆转录PCR（ Reverse T ranscription - PCR , RT - PCR）
逆转录PCR也叫反转录PCR，将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增相结合，是PCR的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中首先经反转录酶将一条单链RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。RT-PCR技术灵敏且应用广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通过一步法或两步法进行，一步法是RT反应和PCR反应在同一试管中进行；而在两步法中两个反应是分开依次进行的。
4.实时荧光定量逆转录PCR（Real-time RT-PCR, RT-qPCR）
Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的组合，其中的“RT”是Reverse transcription（逆转录）的意思，所以RT-qPCR就是结合了荧光定量技术的逆转录PCR，即以mRNA或总RNA为模板，先反转录得到cDNA，再以cDNA为模板，通过荧光定量PCR进行定量检测分析。因为RT-PCR只可以定性，但不能进行定量分析。与RT-PCR一样，RT-qPCR定量分析RNA也有两种方法：一步法和两步法。两种方法都需要先将RNA反转录为cDNA，然后再将其作为qPCR扩增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一试管中进行，两步法中的RT和qPCR是按顺序分开进行。
5.数字PCR（Digital PCR, Dig-PCR, dPCR）
数字PCR被称为第三代PCR技术，它是一种核酸分子绝对定量（直接定量更准确一些！！）技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量，可针对核酸分子做更精确的定量分析。其创新之处在于， PCR反应体系经过微滴制备可将目标分子DNA或RNA样品分割至数千到数万个独立的反应单元中，然后对众多微反应单元内的靶序列进行单分子模板 PCR 扩增，实现”单分子模板PCR扩增”。扩增结束后含有目标分子模板的单元会发出荧光信号，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出目的分子的浓度或拷贝数。目前的数字PCR技术在病原体筛查、NIPT检测、肿瘤突变检测等方向已得到广泛应用。
相较于第一代普通PCR和第二代qPCR，数字PCR具有以下优势：
优点：无需标准曲线即可对目标分子进行绝对（凡事无绝对，直接更准确）定量；测试结果可直接给出样本具体的浓度/拷贝数，而非CT值；（抑制剂）耐受性强，通过把模板分散到各个反应微单元，能够有效降低抑制剂对扩增的影响，可以实现单分子PCR扩增，非常利于复杂样本和突变样本的检测，具有比传统荧光定量 PCR 更加出色的灵敏度和精确性；可通过荧光编解码实现多重/超多重PCR检测。有个超多重数字PCR培训班干货满满，可以去蹭课哦！链接：超多重数字PCR 黄埔军校
缺点：需要根据不同的模板序列，合成不同的探针；成本相对较高。
图4 dPCR的工作原理
自从PCR技术被浪出来：PCR传奇史：“浪”出来的生物技术，经历了飞速的发展和技术更新，新冠的洗礼，让所有人都了解到了“核酸检测”的技术。
然而，对于初学者来说，PCR技术的名称和原理往往令人感到困惑，傻傻分不清。某个小伙伴尝试给让你搞懂PCR、qPCR、dPCR、RT - PCR 、RT-qPCR、Real-Time PCR之间的区别和联系。
如果你已经完全分清了，建议继续：多重PCR——病原体检测体系设计原则
1. 普通PCR(就是只做核酸的扩增哦！！！)
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），即一代PCR，是1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Kary Banks Mulis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。其原理类似于DNA的天然复制过程，在体外条件下以指数级速度扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析。PCR由变性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Extension）三个基本反应步骤构成：
①变性：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成为单链。这一步骤通常在94℃至95℃的高温下进行，持续30秒至1分钟，确保双链DNA完全解离。
②退火（复性）：当温度降低时，引物与模板DNA中互补的区域结合成杂交分子。退火温度通常低于引物本身的变性温度，一般在50℃至65℃之间，持续30秒至1分钟，确保引物与模板DNA特异性结合。；
③延伸（Extension）：在DNA聚合酶、dNTPs（四种脱氧核糖核苷三磷酸）和Mg2+等存在下，DNA聚合酶催化引物按照5′→3′方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。延伸温度通常在70℃至75℃之间，持续时间根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度而定。
图1 PCR的基本反应原理
如果想用于核酸的检测，其实还需要进行凝胶电泳的辅助。所以很多人认为的第一代PCR，其实更应该像是凝胶电泳技术，而不是PCR技术本身！！！
经过演化和革新，PCR技术已经发展了三代：普通PCR技术（PCR+凝胶电泳）、实时荧光定量PCR技术（qPCR）以及数字PCR（dPCR）技术。
第一代PCR主要缺点：容易发生非特异性扩增和假阳性结果；检测耗时长，操作繁琐；
只能做定性检测。目前，在临床检测中普通PCR已经成为测序等检测技术的前处理方法，没有太多的独立应用空间。在食品药品等检测和分型中，还是不少国家标准的检测技术（毕竟标准的变革不宜那么频繁！！！要加把劲了，跟上新技术。）
2.实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）
实时荧光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团，在整个PCR过程中通过收集荧光信号实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，最后通过标准曲线和CT值对待测样品进行定量分析。qPCR常用的有两种方法：SYBR Green法和TaqMan探针法。
①荧光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是荧光定量PCR中最常用的荧光染料，它能与所有的双链DNA结合。在PCR反应体系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就会在过程中与双链DNA结合，从而产生荧光信号。因此，反应中发出的全部荧光信号就会与反应中双链DNA的量呈正比，荧光强度也会随着产物的增加而增加。但是由于染料与双链DNA是非特异性结合，如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确，因此可能产生假阳性的结果。
优点：价格相对较低；使用方便；检测灵敏度高。
缺点：检测特异性较低，可能产生假阳性结果；无法进行多重PCR检测。
图2 荧光染料法的工作原理
②荧光探针法（TaqMan技术）：TaqMan探针是最早用于定量的方法，也是临床检测中最常用的检测方法。PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针是一个寡核苷酸，5'端标记一个荧光报告基团（Reporter, R），3'端标记一个淬灭基团（Quencher, Q）。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，以至于无法检测到荧光信号；而当PCR扩增时（在延伸阶段），探针会被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，报告基团发射底的荧光不会再被吸收，从而可以在荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA，就形成一个荧光分子，PCR产物的形成与荧光分子的形成完全同步，PCR产物越多，荧光信号累积的越多，荧光强度越大。
优点：检测特异性强；灵敏度高；适合进行多重qPCR检测。
缺点：需要根据不同的模板序列，合成不同的探针；靶序列浓度极低或存在大量非特异性扩增时，无法准确定量。
图3 荧光探针法的工作原理
3. 逆转录PCR（ Reverse T ranscription - PCR , RT - PCR）
逆转录PCR也叫反转录PCR，将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增相结合，是PCR的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中首先经反转录酶将一条单链RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。RT-PCR技术灵敏且应用广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通过一步法或两步法进行，一步法是RT反应和PCR反应在同一试管中进行；而在两步法中两个反应是分开依次进行的。
4.实时荧光定量逆转录PCR（Real-time RT-PCR, RT-qPCR）
Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的组合，其中的“RT”是Reverse transcription（逆转录）的意思，所以RT-qPCR就是结合了荧光定量技术的逆转录PCR，即以mRNA或总RNA为模板，先反转录得到cDNA，再以cDNA为模板，通过荧光定量PCR进行定量检测分析。因为RT-PCR只可以定性，但不能进行定量分析。与RT-PCR一样，RT-qPCR定量分析RNA也有两种方法：一步法和两步法。两种方法都需要先将RNA反转录为cDNA，然后再将其作为qPCR扩增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一试管中进行，两步法中的RT和qPCR是按顺序分开进行。
5.数字PCR（Digital PCR, Dig-PCR, dPCR）
数字PCR被称为第三代PCR技术，它是一种核酸分子绝对定量（直接定量更准确一些！！）技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量，可针对核酸分子做更精确的定量分析。其创新之处在于， PCR反应体系经过微滴制备可将目标分子DNA或RNA样品分割至数千到数万个独立的反应单元中，然后对众多微反应单元内的靶序列进行单分子模板 PCR 扩增，实现”单分子模板PCR扩增”。扩增结束后含有目标分子模板的单元会发出荧光信号，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出目的分子的浓度或拷贝数。目前的数字PCR技术在病原体筛查、NIPT检测、肿瘤突变检测等方向已得到广泛应用。
相较于第一代普通PCR和第二代qPCR，数字PCR具有以下优势：
优点：无需标准曲线即可对目标分子进行绝对（凡事无绝对，直接更准确）定量；测试结果可直接给出样本具体的浓度/拷贝数，而非CT值；（抑制剂）耐受性强，通过把模板分散到各个反应微单元，能够有效降低抑制剂对扩增的影响，可以实现单分子PCR扩增，非常利于复杂样本和突变样本的检测，具有比传统荧光定量 PCR 更加出色的灵敏度和精确性；可通过荧光编解码实现多重/超多重PCR检测。有个超多重数字PCR培训班干货满满，可以去蹭课哦！链接：超多重数字PCR 黄埔军校
缺点：需要根据不同的模板序列，合成不同的探针；成本相对较高。
图4 dPCR的工作原理
综上所述，PCR技术被浪出来之后，经历了凝胶电泳技术，实时荧光定量PCR（qPCR）技术和数字PCR（dPCR）技术，其中实时荧光定量PCR技术已经发展相对成熟，数字PCR技术还在不断地发展中。当然，除了上述名词之外，还有不对称PCR，Touchdown PCR，ARMS PCR，巢氏PCR等诸多概念，想要了解地更清楚，不想做幕后的小白一样傻傻的分不清，还需要不断地学习才行。古德拜！
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