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5xFAD小鼠（五转）五转家族性阿尔茨海默病模型小鼠

一、疾病概述

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是较常见的神经退行性疾病，也是比较常见的痴呆疾病（dementia），随年龄的增长其发病率逐渐增加。阿尔茨海默病的致病机制尚不明确，主要分为家族性阿尔茨海默病（familial AD, FAD）和散发性阿尔茨海默病（sporadic AD, sAD）。疾病的病理表现集中在神经元之间的淀粉样蛋白斑块沉积，神经元细胞内的磷酸化Tau蛋白和神经原纤维缠结，海马区和新皮层区弥散性的神经元丢失。

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD） 临床症状主要为记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现，起病隐匿，呈进行性发展。 病理表现主要为脑组织萎缩、神经纤维缠结、老年斑形成和大量淀粉样蛋白沉积。 发病机制尚不明确，从目前研究来看，该病的可能因素和假说多达30余种，主要发病机制假说包括Aβ毒性假说，Tau蛋白代谢异常，神经炎症，胆碱能损伤，金属离子代谢紊乱，糖脂代谢紊乱，自由基损伤，神经血管功能失调，线粒体功能紊乱，兴奋性氨基酸毒性、病毒感染等。

由于 AD 的病因与机制的复杂性，研究人员试图通过多种方法建立多因素作用的 AD 动物模型。遗传学研究提供了更多的 AD 致病基因，使人们能设计和制备出新的同时转入多个基因的 AD 模型小鼠。通过对已存在的 AD 转基因小鼠相杂交、附加额外的基因等技术创造转双基因或多基因的小鼠，可以更加接近 AD 的真实病理学变化，并可以对不同 AD 相关因素的相互作用进行研究。对研究 AD的病因、发病机制和探索相应的治疗药物非常有利。

国内外相关的研究团队和学者一直在探索建立转多基因的 AD 动物模型中，携带 5 个家族性基因突变的 APP /PS1 AD 转基因模型小鼠 ( transgenic mice with five familial Alzheimer's disease，5 × FAD) 为近期较新的 AD 模型小鼠，该小鼠具有 AD 相关的 5 个突变位点，其中与 APP 相关的突变为 K670N/M671L( Swedish) 、I716V ( Florida) 和 V717I ( London) ，与PS1 相关的突变为 M146L 和 L286V。这些突变可以增加 Aβ42 的生成和促进 AD 的发病，是在 APP /PS1 转基因模型小鼠的基础上更加接近临床 AD 病理特征的新的 AD 模型。

二、基本信息

品系名称：B6.CgTg(APPSwe,APPf1,APPlon,PSEN1M146L,PSEN1L286V)6799Vas/Mmjax

别名：5XFAD, Tg6799, Tg-5xFAD

物种：小鼠

转基因：APP，PSEN1

突变：APP K670_M671delinsNL (Swedish) ，APP I716V (Florida)，APP V717I (London)，PSEN1 M146L (A>C)，PSEN1 L286V

编辑类型：APP - 转基因；PSEN1 - 转基因

疾病相关：阿尔茨海默病

遗传背景：C57BL/6

构建策略：表达5个与AD相关的突变

突变的APP：K670N / M671L（瑞典）、I716V（佛罗里达）、V717I（伦敦）；

突变的PSEN1：M146L、L286V

这些转基因小鼠是通过共注射两个编码APP（带有瑞典型K670N/M671L，佛罗里达型I716V和伦敦型V717I突变）和PSEN1（带有M146L和L286V突变）的载体，每个载体由小鼠Thy1启动子驱动制成的。转基因插入到单个位点Chr3:6297836 (Build GRCm38/mm10)，不影响任何已知基因 (Goodwin et al., 2019)。初代杂交的B6SJL背景的小鼠已被回交至C57BL6小鼠至少五代。

5xFAD小鼠表达人类APP和PSEN1转基因，共有五个与 (Alzheimer's Disease, AD) 相关的突变：APP的瑞典型（K670N/M671L），佛罗里达型（I716V）和伦敦型（V717I）突变，以及PSEN1的M146L和L286V突变。5xFAD小鼠初代在B6SJL杂交背景上创建（此遗传背景小鼠的介绍见5xFAD (C57BL6xSJL)）。然而，许多实验室更喜欢使用C57BL/6背景的小鼠，并且通过回交已经产生了自己的同源近交系。The Jackson Laboratory提供C57BL/6J背景的5xFAD小鼠。

此文的描述是指杂合APP和PSEN1转基因小鼠。与杂合5xFAD小鼠相比，纯合小鼠表现出更严重的淀粉样病理；行为缺陷也更严重和/或具有更早的发病年龄（Richard et al.，2015）。

★双转、三转、五转鼠差别

病理、电生理、行为学指标出现的时间点不同（单位：月）

数据来源于https://www.alzforum.org/

5xFAD (B6SJL)。这是初代的5xFAD品系，为B6SJL杂交背景。在公开的报道中，B6模型的表型略于B6SJL（几乎所有的纯背景AD模型表型都弱于混合背景）。B6模型更便于回交，大规模的B6SJL来做毒理（800只规模）在国内非常困难。

三、特点

淀粉样蛋白斑块（Amyloid plaques）是β-淀粉样蛋白（β-amyloid, Aβ）的沉积，是AD的典型病理特征。

淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein, APP）属于I型跨膜蛋白，人类APP基因位于21号染色体，共18个外显子，约100~130kb。研究发现APP可在神经系统发育过程中发挥重要功能，但具体生理作用尚未清楚。APP可被α-，β-和γ-分泌酶（secretase）剪切，形成细胞外α-，β-和γ-淀粉样蛋白的病理特征。APP基因的突变与早发性家族性AD（familial AD, FAD）密切相关.

Aβ蛋白是APP的水解形式，需要经过β-和γ-分泌酶（secretase）的剪切。首先，β-分泌酶剪切APP形成Aβ的N端，得到膜结合片段C99和分泌型APP胞外域APPsβ。随后，C99经γ-分泌酶剪切，产生Aβ的C端。γ-分泌酶的剪切不是精确剪切，可生成一系列Aβ多肽，其长度分别为38-43个氨基酸不等。一般情况下产生的Aβ40较多，Aβ42较少。Aβ42蛋白与短的Aβ蛋白相比更易产生纤维，Aβ42浓度增加与淀粉样蛋白斑块的不溶性纤维形成有关。已有大量证据表明早发型家族性AD与Aβ42蛋白相关，提示Aβ42在AD过程中发挥病因学作用。常染色体显性突变的APP、PS1、PS2基因与Aβ42蛋白的表达增高有关，并引起FAD。FAD中突变型的APP容易出现在β-或γ-分泌酶结合位点附近的聚集，导致Aβ总量增加。PS1和PS2是γ-分泌酶复合体的亚基，FAD的早老素presenilin突变也促进Aβ42增加。

（一）表型概览

1、斑块

观察到海马、皮质、丘脑和脊髓中的淀粉样斑块。5 × FAD 小鼠模型 Aβ 生成明显增加，研究表明 5×FAD 小鼠迅速并且持续地产生中枢内 Aβ42的聚集，神经元细胞内的Aβ42蛋白自1.5月龄起出现，先于淀粉样蛋白斑块形成，主要定位于神经元的胞体和突起。随着小鼠月龄增长，Aβ42蛋白表达几乎呈线性增加。2月龄起出现淀粉样蛋白沉积和胶质细胞增生，特别是在海马下托和皮层深部。6月龄时可见大量蛋白沉积。9月龄时，CDK5活化亚基p25表达增加。

 2、缠结

无数据。

3、神经元损失

皮层V层的大锥体神经元和下托的神经元丢失。12月龄时，第V层锥体神经元大约损失40％。

4、胶质增生

小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生与淀粉样斑块相关。小胶质细胞增生与血管损伤相关。

5、突触损失

与仅表达黄色荧光蛋白（YFP小鼠）的小鼠相比，5xFAD小鼠与表达黄色荧光蛋白（YFP小鼠）的小鼠杂交后，体感和前额皮质的锥体神经元的神经突（spine）密度减少，但海马区没有。突触标记物synaptophysin、syntaxin和PSD-95随着小鼠月龄增长而表达降低。

6、LTP / LTD的变化

虽然可以在野生型小鼠的第V层神经元中诱导脉冲时序依赖性长时程增强（STD-LTP），但是同样的刺激流程会在5xFAD小鼠的神经元中诱导长时程抑制（LTD）。

7、认知障碍

空间工作记忆受损和焦虑减少在3至6个月之间出现并随着年龄加重。

（二）表型详情

1、神经病理

表达FAD基因APP和PS1突变的转基因小鼠可过表达Aβ42，表现出与AD疾病过程相似的淀粉样蛋白病理，但大多类似的模型产生斑块需要的时间较长。5XFAD小鼠是同时表达五个家族性AD突变基因的APP/PS1双转基因小鼠模型，此品系模型小鼠可表达大量Aβ42，在2月龄出现大脑淀粉样蛋白和胶质增生病理表型。淀粉样病理早期出现且较严重的是海马下托（Subiculum）和皮层第V层。在年轻至16天的动物中，免疫组织化学手段在海马下托和第V层锥体神经元中检测到人类APP，并且6周时在这些神经元中观察到细胞内Aβ（Richard et al., 2015）。在2月龄的动物中，免疫组织化学检测到海马、皮层和丘脑的细胞外淀粉样斑块（Richard et al., 2015）。在3月龄时，脊髓中也观察到细胞内Aβ和细胞外斑块，这是被检出的小的年龄（Jawhar et al., 2012）。前额叶、顶叶、内嗅皮层和齿状回中的硫黄素S（Thioflavin-S）阳性斑块在2至4月龄之间出现（Giannoni et al., 2016）。在5xFAD小鼠中发现的斑块含有N-末端截断的Aβ（Guzmán et al., 2014; Savastano et al., 2015; Wirths et al., 2017）。

这个模型中的营养不良性神经突(dystrophic neurites)（Jawhar et al., 2012）、小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生与淀粉样斑块相关。

小鼠出现渐进性脑部淀粉样血管病（progressive cerebral amyloid angiopathy, CAA），开始于大约3月龄（Giannoni et al., 2016）。在5xFAD和野生型小鼠的大脑中，微小血管泄漏随着年龄的增长而增加，但在转基因动物中更严重。虽然微血管损伤很常见，但与微血管周围小胶质细胞增生、淀粉样沉积物相关的很少。

在与表达黄色荧光蛋白（YFP）的小鼠进行交配的5xFAD小鼠中观察到特定突触的丢失。与仅表达YFP的小鼠相比，6月龄的5xFAD-YFP小鼠的体感和前额皮质锥体神经元中的神经突密度减小，但海马中并未减少（Crowe和Ellis-Davies，2013）。

5xFAD小鼠中的第V层锥体神经元数量下降约40％，但（前额）皮层整体和海马CA1中的神经元数量与野生型小鼠没有区别（Jawhar et al., 2012）。

在小鼠1月龄时，就存在髓鞘异常，并且随着年龄的增长变得更加严重。1月龄时，在5xFAD小鼠的多个脑区域中，与野生型小鼠相比，看到了髓鞘基础蛋白的水平降低（Wu et al., 2018），以及髓鞘的减少（Gu et al., 2018）。髓鞘随着年龄变得更薄，形态上异常的髓鞘（髓鞘分裂、轴突具有两层髓鞘，髓鞘外折、髓鞘鼓胀）在转基因小鼠中更早出现并更频繁（Gu et al., 2018）。在这种模型中，轴突也受到影响：2至3月龄的CA1和感觉皮层中的轴突直径减小（Gu et al., 2018），并在3月龄的小鼠中观察到多个脑区的轴突肿胀，表明轴突正在退化，与斑块无关（Jawhar et al., 2012; Richard et al., 2015）。

2、电生理

从8至12周的小鼠中获得了突触缺陷的电生理证据（Buskila et al., 2013）。第V层神经元的微型兴奋性突触后电流（miniature excitatory postsynaptic currents, mEPSCs）的频率和幅度降低，分别反映了突触前和突触后的功能障碍。第V层神经元还显示出异常的突触可塑性：虽然野生型小鼠的第V层神经元诱导了脉冲时序依赖性长时程增强（spike-timing-dependent long-term potentiation, STD-LTP），但是同样的刺激流程在5xFAD小鼠的神经元中诱导了长时程抑制（long-term depression, LTD）。尽管II / III层中神经元的特性在不同基因型之间没有区别，但5xFAD小鼠的第V层神经元更难被激活。

3、行为

4-5月龄5XFAD小鼠与对照组相比表现出Y迷宫自发交替行为（spontaneous alternation performance）的学习记忆下降。Y迷宫进入迷宫臂的总次数无明显差异，提示5XFAD小鼠的运动功能和探索能力正常。5XFAD小鼠在线索和环境的条件恐惧记忆实验表现出学习记忆能力下降。5XFAD小鼠在水迷宫实验，以及其他海马依赖的记忆实验中也表现出学习记忆能力的下降。

在十字迷宫测试中评估的空间工作记忆障碍在3至6月龄之间出现，并随着年龄的增长而恶化（Jawhar et al., 2012）。（十字迷宫测试类似于但可能比Y迷宫更敏感，因为测试设备由四个臂组成而不是三个。与Y迷宫相似，在十字迷宫中的自发转向用于评估工作记忆。）探索行为（入臂总次数）在5xFAD和野生型小鼠中至少直到12月龄不变。焦虑的逐渐减少（在高架十字迷宫中测量），在3至6个月之间出现。5xFAD小鼠的焦虑减少在旷场实验（open field）也可以看到，但在这个测试中，转基因小鼠与野生型小鼠之间的差异直到9至12个月后才出现。在开放场地中的运动能力（locomotor activity）在至少12个月内正常（Jawhar et al., 2012）。

一组报告称至少到2月龄的水迷宫中的空间记忆功能正常（Richard et al., 2015），而第二组报告称，在一个月大的小鼠中就出现了水迷宫中的记忆障碍（Gu et al., 2018; Wu et al., 2018）。这种差异可以追溯到记忆障碍的定义方式不同。一组的结论是记忆功能正常，因为转基因小鼠在探索试验中对目标象限表现出明显的偏好（即小鼠在训练试验期间，在水池的逃生平台所在象限中度过测试的25％以上）。第二组比较了5xFAD和野生型小鼠之间的目标象限占用率，并发现转基因小鼠在目标象限中花费的时间略微较少，尽管两种基因型似乎都偏爱该象限。此外，使用第二个测量标准 - 平台穿越次数 - 5xFAD小鼠与野生型小鼠之间存在小、但具有统计学意义的差异。

在9月龄的小鼠中观察到平衡木（balance-beam）和绳悬挂（string-suspension）测试中的感觉运动缺陷（Jawhar et al., 2012）。

反射异常，具体表现为尾悬挂测试中的后肢和前肢紧握，在5个月大的小鼠中发现（Richard et al., 2015）。

4、组学

在2至4个月的年龄段，5xFAD和野生型小鼠的海马中的差异表达基因数量激增 - 从2个月的42个转录本增加到4个月的1,300个以上（Bundy et al., 2018）。

基因分类 (Gene Ontology) 分析表明，在4个月的5xFAD中上调的基因与免疫激活相关。在雌性（766）中，发现的差异表达基因多于雄性（537）。在4个月的5xFAD中，相对于雄性，雌性发现略微增加了人类APP和PSEN1 mRNA的水平。

5、其它

锰增强磁共振成像（MEMRI）已被用于绘制5xFAD小鼠大脑区域活动图谱 (Tang et al., 2016; Nie et al., 2019). 。在转基因和野生型小鼠之间看到了年龄依赖性的区域特异性差异，转基因小鼠的海马区和杏仁核区的活动在1至5月龄（用于研究的大月龄）期间一直升高。与野生型小鼠相比，5xFAD小鼠的体重降低 (Jawhar et al., 2012; Richard et al., 2015).