一、引言

随着老龄化社会的到来，老龄医学研究已经成为了一个非常棘手、非常重要的课题。根据人口普查数据显示，现在全国65岁及以上人口已达到了总人口13. 5%，这个数字相当于是1. 9亿人，2035年预计数值将达25%，可以说是一个深度老龄化社会。

与老龄化社会一起到来的，必然是衰老相关的疾病的发生，例如阿尔兹海默症、老年抑郁症、骨关节炎或者是肿瘤等等。这些伴随衰老过程中产生的疾病背后，揭示着衰老是由一系列分子和细胞层面的变化积累造成的，比如人类基因组失去了稳定性，端粒消减线粒体功能发生了缺陷，这些都会导致单个细胞的衰老和死亡。同时干细胞的耗尽，细胞间的交流发生改变，导致新生的细胞产生受到了一些阻碍。

这些发生在分子和细胞层面上的改变，在人体基层层面展现出来是具有一个时间依赖性和渐进性的，逐渐就会发展表现为老年人中存在的一些正常的生理功能的丧失，或者是与一些致病因素发生相互作用，从而导致了一些比较异常的损伤，以及造成了与衰老相关的疾病的产生。但是针对人类衰老研究，比较现实的一个问题是它的周期非常的漫长，也需要多种资源配合，以及非常详细的提前规划。

由于小鼠和人类在遗传机理和生理表征上都有非常高的相似性，所以小鼠模型已被广泛应用于人类衰老的医学研究。目前老龄小鼠模型已经是被用于了诸多研究课题中，根据NIH归纳项目报告，目前老龄小鼠模型已经适用于如健康生命周期研究、骨质疏松、肌肉萎缩、心脑血管疾病、与年龄相关的免疫功能变化、视力听力障碍等等关于老龄化疾病的各个方面。在这些研究中，我们常会使用到的小鼠，其中一个就是C57BL/6J 小鼠，它是使用较广泛的近郊小鼠品系，也是初个被全基因组测序的小鼠品系。截止目前，现有大概36000 个已发表的研究是以它作为一个研究对象。这也使品系成为了一个特征表型分析较为全面的一个小鼠品系。在使用它进行研究的过程中，也有非常多的既往研究和数据可用参考。

二、C57BL/6J老龄鼠背景知识

（一）C57BL/6J老年小鼠品系

C57BL/6J，简称B6，1921年 Little（立特）由Abby Lathrop（艾比·拉特洛坡小鼠株）得到动物后开始近亲交配育成数个近交系。1937 年分开C57BL/6 及C57BL/10 两系。C57BL/6J 保种于 JAX 。1986 年日本实验室引进到中科院上海实验动物中心，2001 年再次从美国再次引种。B6是黑色近交系小鼠，乳腺肿瘤自然发生率低，化学物质难以诱发乳腺和卵巢肿瘤。对放射物质耐受力中等，补体活性高，较易诱发免疫耐受性；对结核杆菌敏感；对鼠痘病毒有一定抵抗力。干扰素产量较高，对百日咳组织胺易感因子敏感，嗜酒精性高；肾上腺素类脂质浓度低。常被认作“标准”的近交系，为许多基因编辑小鼠提供遗传背景。

（二）小鼠与人类生命阶段的对应关系

很多研究者在需要使用老龄鼠进行研究时，会对老龄鼠的具体月龄产生困惑。下图给出了小鼠月龄和人类年龄的对应关系，它们分为三个阶段：成年鼠、中年鼠、老龄鼠。

因为我们使用小鼠去进行人类疾病研究，必须要了解小鼠的不同年龄阶段是怎么去对应到人类的一个生命周期的。和人一样，小鼠也经历着与年龄相关的变化过程和疾病的发展过程，所以了解这样的一些过程是对我们实验设计至关重要的。首先，要明确一点是小鼠的成熟速率和人类是没有一个线性相关性的，所以在小鼠出生到1月龄的时候，它乘除速率大概是可达到人类的150倍，而之后在1到6个月，速度会下降至45倍速。在之后6个月以上的时，速度将会继续下降至人类的25倍速。

1、成年小鼠（3-6月龄）：发育完成但尚未受到衰老的影响

3–6 月龄成年鼠(middle-aged)：无论是研究发育、成熟、还是衰老，都以成年作为对照参考。虽然小鼠的性成熟在 35 天（5 周）左右，但小鼠体内许多生物学过程和结构的快速成熟生长仍持续到三月龄（体成熟或者叫完全成熟）。所以成年（adult）的小鼠至少是 12 周（3 月龄），上限通常为 6 个月，相当于人类的 20-30 岁。超过 6 个月，小鼠会出现一些与年龄有关的变化（比如雌性小鼠在 7-8 个月时产仔数减少，不再作为繁殖种群）。

2、中年小鼠（10-14月龄）：可以检测到一些（并非所有）衰老生物标志物的衰老变化

10–14月龄中年鼠的衰老程度可以根据小鼠体内与衰老相关的生物标志物的监测来判断，中年小鼠是指部分衰老相关的标志物出现衰老变化。如果进行衰老相关的研究，通常会在设计时设置一组中年小鼠对照组，来确定相关变化是否仅在老年期出现。中年小鼠的年龄应至少 10个月大，上限通常为14-15个月，相当于人类的 38-47岁。在这个时间段里，大多数生物标志物已经开始出现变化。

3、老年小鼠（18-24月龄）：所有动物的几乎所有生物标志物都可以检测到衰老变化

18–24 月龄老年鼠是指在小鼠体内几乎所有生物标记物都可以检测到衰老变化。老龄小鼠应至少 18 个月大。对于C57BL/6J小鼠和许多近交系小鼠，上限为24 个月，相当于人类的56-69 岁。但老龄鼠的年龄上限取决于具体品系，小鼠品系不同可能老龄鼠的上限会更高。并且，小鼠品系的特定疾病也会影响生物标志的检测结果，应以尸检和组织病理学评估为准。

（三）C57BL/6J老龄鼠的常见特征、表型与相关资源

1、C57BL/6J老龄鼠的正常表型

伴随着年龄的增长，小鼠的外观是会发生一些改变的，接下来给大家展示一些常见的衰老过程中的一些表型。在这里列出三个B6/J老龄鼠的照片，供大家参考。

（1）区域性脱毛

脱毛可能是由于小鼠自身有一个过度的梳理行为，或者是同伴间有一个互相礼毛的行为，造成了一个脱毛。这样的行为和它的性别、年龄都是有相关性的，其实是属于小鼠的一种正常的社交行为，所以可以看到左边的这两张图，小鼠是出现了一个眼周局部的脱毛，以及因为被同伴理毛而导致嘴鼻处有胡须的脱落。另外还比较常见的就是老龄鼠背毛会变薄，呈现出灰色或者是棕色。这些外观在 B6/J老龄鼠里面是属于一个正常的老年特征，它与疾病的发生是没有关系的。

（2）体重

随着年龄的增长小鼠首先它的体重会随着年龄的增长而不断的增长，同时我们可以看到它数值也是变得不稳定，个体之间的差异也在变大。C57BL/6J老龄小鼠10月龄后体重会增加到32 克以上（小鼠来源、饲料也有可能造成小鼠体重增加），15月龄以后常规体重都会达到33克以上，18月龄老年雄鼠体重常规在32克-38克之间。老年雄鼠后期尽量不要合笼（老年鼠后期合笼一周内每天喷洒酒精，以小鼠体表湿透为原则），随机合笼可能会出现打架发炎等情况。雌鼠正常在八个月以后退役鼠合笼，正常雌鼠在体重在 23 克以上 ，雌鼠年龄超过 18 月-21 月龄以后体重常规都在29克以上，22月龄雌鼠体重一般都会超过 30克，有些甚至可以达到40克左右，雌雄小鼠年龄一般超过15月龄容易出现打架、舔毛、脱肛、白内障、自发性肿瘤等。

C57BL/6J小鼠从24周至78周（18月）的体重变化

（3）体脂、葡萄糖代谢率

另外身体组份的发生，比如它的体脂比会发生改变，从25- 76周这样一个范围。整体上，小鼠的身体脂肪含量是随着年龄的增长有一个明显的增长。而且这里面看到雌鼠和雄鼠，它的变化趋势也是略有不同的。雌鼠26- 52周是有一个快速增长，而雄鼠是前期有一个小幅的下降，随后是有一个快速的脂肪增长。还比如葡萄糖的代谢也会随着年龄的变化而发生一些变化。如果我们的研究中是会涉及到比如身体组份或者是葡萄糖的代谢，我们就会非常关注这些随着年龄因素而引发的变化，因为它有可能会影响我们实验的一个设计。

（4）C57BL/6J老龄鼠听力下降

（5）老龄鼠CDT8+T增加

在老龄化的大脑组织中有明显增加的CD8+T细胞，CD8+T细胞会随衰老积累，损伤神经，导致认知和运动能力衰退。当CD8+T细胞数量减少、无法被激活或表达细胞毒性效应分子减少的时候，变老给大脑带来的损伤都明显地减小，衰老带来的运动能力减弱也有一定的恢复。

老年鼠和小鼠全组织驻留区室的光谱流式细胞术T细胞的表型变化

2、C57BL/6J老龄小鼠行为学特性

成年（2-6个月大）和老龄（18个月以上）动物之间存在许多与年龄相关的行为差异。在过去的二十年中，基因靶向技术的进步使我们能够在小鼠体内产生靶向的基因突变，这使研究人员增加了使用基因突变小鼠模型来研究大脑衰老与行为之间的关系的兴趣。尽管大量的研究将成年和老龄动物进行了比较，并且对突变模型的研究日益增加，但有关C57BL/6J背景鼠从成年到中年（约2-12个月大）的年龄相关行为变化的信息仍然相对较少。

（1）体重增加，神经肌肉力量和疼痛敏感性减弱，运动功能障碍

（2）自主活动减少，焦虑行为改变

（3）社交活动减少

（4）老龄C57BL/6J小鼠的声惊吓反应降低和预脉冲抑制增加

（5）老龄C57BL/6J小鼠的强迫游泳刺激反馈降低

 （6）空间学习和记忆力受损

（7）老龄C57BL/6J小鼠性恐惧记忆减少

3、C57BL/6J老龄鼠的临床表现

伴随衰老产生的除了一些我们所说的正常的表型，也会发生一些和疾病相关的表型。

（1）直肠脱出

小鼠由于直肠比较短，在衰老的过程中，因盆腔肌肉组织的萎缩，会导致直肠相对来说更容易脱出。目前针对于直肠脱出没有非常有效的治疗方法。轻症的时候可能它并不影响存活，但是情况严重的时候就有可能考虑要进行安乐死。

（2）眼部病变

相对来说，小鼠它的角膜面积更大，所以也更容易接触到一些异物，导致发炎。另外伴随着衰老的过程，泪腺萎缩，还有一些慢性炎症都会导致泪液的减少，角膜的过度损伤，之后就会呈现出眼球浑浊等病变的表型。

（3）脱毛和皮炎

和理毛或者社会社交行为导致的非疾病性脱毛还是有一些区别，这个理毛更多的时候是因为打斗或者是感染而引起的溃烂性皮炎，进而导致的脱毛。这时候根据实际情况，我们可能要进行一个分笼饲养，对小鼠修剪指甲或者是进行一些给药的处理，甚至在情况严重的时候可能需要考虑到是不是要进行安乐死。

（4）可触及的肿块

这种皮下或者是体内可触及的肿块，可能是伴随着是衰老过程中有肿瘤的，或者是一个囊肿的。产生过大的肿块将直接的影响就是会影响到小鼠的活动能力，进而也可能会对它的健康状况产生一些影响。

老龄小鼠良性退行性和炎性病变举例

三、老龄鼠表型测定方法

四、设计老龄鼠实验的注意事项

1、您需要多少只小鼠？因为根据小鼠的存活数据曲线，雌性和雄性的小鼠存活率还是有一定差异的，随着时间的延长，损耗率是在不断上升。

2、 实验从何开始？因为有一些表型和指标可能在小鼠的中年期并没有显现。这个时候我们既不希望错过一个数据的理想采集时间，同时也不想因为过早的进行实验而造成人力物力的浪费。

3、小鼠健康状况如何？这个是直接涉及到实验数据是否可信，以及它的可重复性。容许的情况通常包括：皮毛颜色变化、理毛、脱毛、挑拣胡须；不能容许的通常包括：伤口、皮炎、咬合不正、疝气/肿块、其他不良的临床情况。

4、如何辨别单只小鼠？常用的小鼠标记方法包括：耳孔、耳标、微芯片、纹身。

5、雌性和雄性间是否有差别？了解老龄鼠的性二态性，6个月龄的C57BL/6J小鼠表现出葡萄糖耐受异常，且随着年龄增长而加剧与雌性小鼠相比，雄性小鼠的葡萄糖不耐受性更严重。实验中应充分考虑性别差异，并按性别分析数据。

6、实验终点如何设定？因为对于老龄鼠研究来，我们需要从保证实验可靠性和动物福利的两个角度共同去考虑。

五、老龄鼠在疾病研究中的应用

C57BL/6J 老年小鼠的研究应用包括免疫学、癌症、寿命干预措施和生物标志物研究。C57BL/6J 是应用较广泛的近交系，也是初个进行基因组测序的菌株。C57BL/6J 小鼠对听力源性癫痫发作具有抗性，骨密度相对较低，并发展为与年龄相关的听力损失，它们还容易患上饮食引起的肥胖、二型糖尿病和动脉粥样硬化，还经常被用于与神经退行性疾病和骨密度相关的研究。总的来说， C57BL/6J 小鼠繁殖良好，长寿，对肿瘤的敏感性较低。与BALB/c和DBA/2J相比，C57BL/6J小鼠的原始造血干细胞则表现出明显的衰老延迟性。

 覆盖寿命(lifespan)和健康期(health-span)的基础生物学研究；

 免疫学、肿瘤学研究；

 饮食、运动、心血管、内分泌和代谢等疾病研究；

 学习、记忆、认知、睡眠和神经退行性疾病研究；

 年龄相关的视力、听力障碍研究；

 骨骼、肌肉、身体组成相关研究；

1、利用饮食研究应用对寿命的影响

具有相同卡路里数但营养成分不同的饮食可以改变寿命中位数；营养成分也会影响老年动物的骨骼肌力量品系。

2、认知增强剂治疗可改善老龄鼠的认知能力

老龄鼠识别物体转移分离的能力下降；用D-丝氨酸治疗可以逆转与衰老相关的认知能力下降。

3、免疫衰老

六、雌雄性老年鼠的差异

值得注意的是，C57老年鼠的雌雄差异会影响实验结果，因此在使用老年鼠进行实验时，还需要提前了解并采取相应的措施，以确保实验结果的准确性和可靠性。

1、学习能力

雄性C57老年鼠，通常具有更高的活动水平和更强的学习能力，这使得它们相比较雌性老年鼠更适合用于研究神经科学和行为学等领域。

2、药物反应

在药物研究中，雌性老年鼠通常对药物的反应更为明显，因此使用雌性可以更好地观察药物对生物体的影响。

3、下丘脑防御系统细胞特异性神经元性别差异

荧光原位杂交技术分别标记亚型囊泡膜谷氨酸转运体( Vglut2) 以及谷氨酸脱羚酶 2(Gad2) ，从而实现特异性标记下丘脑多个防御相关亚区的谷氨酸能与 V-氨基丁酸(GABA) 能神经元:

下丘脑背内侧核( dorsomedial hypothalamus，DMH) 背侧部( dorsal part of thedorsomedialhypothalamus ， DMHa) 、致密部( compact part of thedorsomediahypothalamus，DMHc) 以及腹侧部( ventral part of the dorsomedial hypothalamus,DMHv)的Vglut2 m R NA 阳性和 Gad2m R NA 阳性神经元的分布图; 

七、老龄鼠应用研究

① 健康生命周期的基础生物学研究

② 骨质、肌肉、身体组成相关研究

③ 饮食、运动、认知与行为研究

④ 心血管、内分泌、代谢等疾病研究

⑤ 免疫学、肿瘤学、神经退行性疾病研究

⑥ 年龄相关的视力、听力障碍研究

C57BL/6J用于广泛的研究领域，包括心血管生物学、发育生物学、糖尿病和肥胖症、遗传学、免疫学、神经生物学和感觉神经研究。其乳腺肿瘤自然发生率低，化学物质难以诱发乳腺和卵巢肿瘤。对放射物质耐受力中等，补体活性高，较易诱发免疫耐受性；对结核杆菌敏感；对鼠痘病毒有一定抵抗力。干扰素产量较高，对百日咳组织胺易感因子敏感，嗜酒精性高；肾上腺素类脂质浓度低。常被认作“标准”的近交系，为许多基因编辑小鼠提供遗传背景。

除此之外，C57BL/6J 对听力源性癫痫发作具有抗性，骨密度相对较低，并发展为与年龄相关的听力损失，它们还容易患上饮食引起的肥胖、二型糖尿病和动脉粥样硬化，还经常被用于与神经退行性疾病和骨密度相关的研究。

八、老龄鼠模型数据

对老龄鼠进行系统性的研究，建立一套新的、更接近疾病自然发生过程的老龄鼠自发疾病模型和应用方法，助力新药研发的进程，提高新药研发临床转化率。

1、年轻和老龄C57BL/6N小鼠血浆和尿液生化变化

C57BL/6N小鼠的血浆和尿液指标，如肌酐(CREA)、总蛋白(TP)、尿素等，在年轻和老龄小鼠之间发生了不同程度的变化。老龄小鼠血浆(A)和尿液(B)中总磷和尿素均增加。老龄小鼠尿液(B)的CREA增加，而血浆(A)的CREA在年轻小鼠和老龄小鼠之间没有差异。

2、衰老对DC诱导的NK细胞活化的影响

NK细胞的体内活化。Poly I:C分别注射于年轻和老龄小鼠；24h后，检测CD69在血(A)和脾(B) 中DCs和NKs上的表达。在老龄小鼠中，注射poly I:C后，DCs和NKs的CD69阳性率显著降低。

体内活化的NKs上IFN-γ和颗粒酶的表达。Poly I:C分别注射于年轻和老龄小鼠；24h后，检测颗粒酶B和IFN-γ在血(A)和脾(B)的DCs和NKs上的表达。在老龄小鼠中，注射poly I:C后，DCs和NKs颗粒酶b阳性率显著降低。老龄小鼠的DCs和NKs中含有IFN-γ的比例较年轻小鼠降低，但差异无统计学意义。

3、抗PD-1抗体对小鼠MC38的抗肿瘤作用

抗PD-1抗体对中青年和老龄小鼠应答的影响。小鼠结肠癌MC38细胞1E5和5E5分别皮下植入年轻、中年和老龄小鼠。当肿瘤体积达到约80~100mm3时，将小鼠分组，同时给予PBS或抗PD-1治疗。如图A所示：当MC38在1E5植入时，抗PD-1 mAb可抑制各年龄组的肿瘤生长，其中老龄组的抗肿瘤作用较好。如图B所示：当接种剂量为5E5时，抗PD-1mAb仅在年轻组小鼠中抑制肿瘤生长，而在中老年组小鼠中，抗PD-1 mAb未抑制肿瘤生长。

九、老龄鼠饲养注意事项

1、分笼时，尽量不要将不同笼盒的小鼠装在一盒里；

小贴士：笼子里的实验鼠从离乳后就一直住在一起，如果和不熟悉的笼子伙伴住在一起，自然会互相争斗

2、更换垫料时，留取一点原来的垫料放在新换垫料的表面，以保留原有的气味。尽量使用原来的笼盒；

小贴士：如果不使用原有笼盒，一定要将换下来的笼盒刷洗干净，并彻底消毒灭菌，以减少残存的味道对其他实验鼠的刺激。

3、降低饲养密度：建议每笼饲养2-3只；动物打架严重时，采取单笼单只饲养；

4、将饲养笼盒放在安静的环境中，笼子和墙壁之间保持一定距离，以减少多余的噪音、振动和其他干扰；

5、每天观察实验鼠，如果发现笼中有打斗现象，请将***强者（身体无伤、胡须完整）挑出单笼饲养；同时对受伤的个体，每日用75%的酒精或碘酒消毒，一般5-7天可以痊愈；

6、在垫料中增加筑巢材料（例如纸屑、纸板隧道和棚屋），可以减少理毛和打斗行为；

7、有证据表明将拧干的碘伏棉球置于小鼠笼内，可减少打斗现象的发生；

8、建议适应性饲养一周以后再开展实验。