【构建非酒精性脂肪肝NASH小鼠模型】

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD，Nonalcoholic fatty liver disease）是一种肝脏中储存过多脂肪的疾病。这种脂肪堆积不是由于大量饮酒引起的，当大量饮酒导致肝脏脂肪堆积时，这种情况称为酒精性肝病。NAFLD有两种类型：单纯性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎（NASH，nonalcoholic steatohepatitis）。NASH是世界范围内肝脏疾病最重要的原因之一，在发达国家已成为最常见的肝脏疾病，在发展中国家的发病率也逐年上升。

2019年称为“Year of NASH”，有4家制药公司的NASH候选药物进入III期临床开发阶段，有近百种药物进入临床试验阶段（Clinical trials）。截至目前，也没有批准的有效的NASH治疗药物和方案。FDA在一份指导文件中表示，NASH治疗成功、纤维化改善或者两者结合是潜在的批准NASH疗法的可接受终点。尽管如此，哪个终点以及哪种药物在该领域最早证明有用，仍没有公认结果。

导致NASH的主要危险因素包括肥胖、II型糖尿病、血脂异常和代谢综合征等。NASH除了肝脏脂肪变性，还包括膨胀、炎症和纤维化。在NASH中后期，炎症和肝细胞损伤可导致肝纤维化或瘢痕形成，可以进一步发展为肝硬化或肝癌。根据这些特点，动物模型研发近些年也取得了较大的进展，特别在纤维化（Liver fibrosis），并最终发展到肝癌（Hepatocellular carcinoma）阶段。肝纤维化是指反复或长期的损伤或炎症导致肝脏内大量瘢痕（scar，纤维化）组织积聚。虽然一些动物研究显示了肝脏自我再生或自我愈合的潜力，但一旦人类的肝脏受损，肝脏通常不会愈合。然而，药物和生活方式的改变有助于防止纤维化恶化，且可以用小鼠模型来进行临床前评价。肝纤维化常参考的指标是人的肝脏纤维化METAVIR 评分系统（METAVIR scoring system,见图1），将纤维化分为4级[1]。纤维化阶段从F0到F4：F0：无纤维化；F1：无间隔门脉纤维化；F2：门脉纤维化伴少量间隔；F3：大量间隔，无肝硬化；F4：肝硬化。

图1. 肝纤维化的分级（F0~F4）[1].

NASH小鼠模型可以分为4类：（1）日粮诱导模型，（2）化学物质诱导模型，（3）基因编辑模型，（4）前面2种，或者3种方法结合在一起的综合模型，这类模型的优点是疾病模型的病理特征最典型和全面。由于纤维化改善是潜在的批准NASH疗法的可接受终点，因而本文重点介绍一下纤维化模型。

1. 日粮诱导模型

采用高脂、高糖、和/或高胆固醇饲料，或者MCD（蛋氨酸胆碱缺乏饲料），可以成功诱导肥胖，或者营养缺乏的NASH模型（详见表1）[2]。比如对于C57BL/6小鼠，采用Research Diets公司 的D12492饲料（高脂饲料，60%脂肪供能），可以诱导肥胖，基本没有纤维化。采用D09100310饲料（NASH饲料，替代FDA禁止使用含反式脂肪酸的饲料AMLN DIET，40%脂肪供能，主要是棕榈油、20 %果糖和2%胆固醇），12~16周诱导出脂肪变性；20~26周诱导出炎性小体；26~34周诱导出纤维化。日粮诱导型NASH模型的特点是，模拟了肥胖、II型糖尿病、血脂异常和代谢综合征等特征，但小鼠肝纤维化比较弱，基本上不会发生HCC。在日粮诱导模型中，添加高比例的果糖、葡萄糖和胆固醇，小鼠的肝纤维化可以达到F2级标准（moderate中度纤维化），是目前应用较多的一种临床前小鼠NASH模型。

表1  营养过剩或者缺乏诱导C57BL/6小鼠的NASH模型

2. 化学物质诱导模型

化学物质诱导的肝损伤和肝纤维化很常见，已用于小鼠肝脏纤维化模型的构建，这类模型发展到肝硬化和肝癌的几率也很高[2]。常用的诱导物有，四氯化碳（CCL4）、硫代乙酰胺（TAA）和链脲菌素（STZ）等。CCL4和TAA常用于成年鼠，STZ用于新生鼠。CCl4和TAA的毒性机制尚不完全清楚，但涉及肝细胞对CCl4和TAA的摄取和转化，代谢产物引起氧化性坏死炎症的反应和分泌胶原蛋白的细胞的过度活化和增殖。用特定背景的新生小鼠，结合高脂日粮和STZ诱导，可以建立“STAM”小鼠模型，其8周表现出NASH的特征，12周出现纤维化，最终接近100%的雄鼠表现出HCC[3].

表2 化学物质诱导的小鼠NASH模型

3. 基因编辑模型

与代谢相关的基因，或者表达对肝脏细胞有损害作用的蛋白，科研工作者研发了许多NASH基因编辑模型（见综述[2]）。这里简介3种NASH基因编辑模型，结合高脂饮食，可以更快和更高比例的获得NASH模型，纤维化特征明显。低密度脂蛋白受体（Ldlr）基因家族，由参与特定配体受体介导内吞作用的细胞表面蛋白组成。Ldlr KO小鼠血清胆固醇水平，是野生小鼠的2~4倍。结合高脂（HFD-fed）饲喂LDLR ko小鼠，可以诱导以肥胖、高胆固醇血症为特征的代谢综合征、高甘油三酯血症和胰岛素抵抗症状；类似于人NASH模型为特征的模型[4]。

图2. 肝纤维化，A.健康人肝脏切片HE染色，B. NASH病人肝脏切片HE染色，C.LDLR ko小鼠肝脏切片HE染色，D高脂饲料饲喂LDLR ko小鼠诱导NASH的肝脏切片HE染色。

Mc4r（黑皮质素4受体）是一种蛋白质编码基因。Mc4r 纯合敲除小鼠在6~8周时，体重高达30g，表现出明显的肥胖。结合高脂（HFD-fed）饲喂Mc4r KO小鼠，更容易表现出肝脂肪变性、肝纤维化和肝细胞癌，类似于人NASH模型为特征的模型 [5]。

尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，uPA)，在细胞外基质的降解过程中发挥重要作用。uPA对肝细胞有毒性，会引起肝损伤。最早在1992年Sandgren等就做出了Alb-uPA转基因小鼠，用来研究肝癌。不过由于uPA的肝毒性，Alb-uPA小鼠在出生4天就会出现溶血症状，最终会大部分死亡。2000年Weglarz等作了改进[6]，做出了MUP-uPA转基因小鼠，使用MUP增强子/启动子在肝细胞中特异性表达uPA， 用来研究肝细胞移植。与Alb-uPA类似，由于基因丢失，uPA的表达会逐渐降低；不同的是MUP-uPA小鼠要到2-4周之后才会开始表达uPA，从而降低新生小鼠的死亡率。2017年在Nature发表了重磅研究[7]，将MUP-uPA小鼠，通过10代回交到了C57BL/6背景，饲喂高脂高糖饮食(WD-SW)，3个月表现出典型的NASH病变，如肝脂肪变性，脂肪性肝炎（包括ballooning hepatocytes and Mallory-Denk bodies），在6~11个月后，90%的小鼠出现HCC。从RNA-seq和组化数据证明，该模型是目前报道的最好的模拟人类NASH和HCC的模型（图3）[8]。

图3 组化和转录分析MUP-uPA小鼠NASH模型和人NASH样本。A.HE染色；B. RNA-seq分析

由于NASH的病因广泛，公认是一种异质性的疾病，因而也为模型的选择带来了困难。缓解纤维化作为潜在的批准NASH疗法的可接受终点，使得动物模型中的纤维化指标变得更为重要。

参考文献：

[1] Animal models of NAFLD from a hepatologist's point of view. BBA - Molecular Basis of Disease 1865 (2019) 943–953. https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2018.06.023

[2] Mouse models of nonalcoholic steatohepatitis in preclinical drug development. Drug Discovery Today. Volume 22, Number 11, November 2017. http://dx.doi.org/10.1016/j.drudis.2017.06.007

[3] A murine model for non-alcoholic steatohepatitis showing evidence of association between diabetes and hepatocellular carcinoma. Med. Mol. Morphol. 2013,46, 141–152.
http://refhub.elsevier.com/S1359-6446(17)30027-2/sbref0305

[4] LDL Receptor Knock-Out Mice Are a Physiological Model Particularly Vulnerable to Study the Onset of Inflammation in Non-Alcoholic Fatty Liver Disease. PLoS One. 2012; 7(1): e30668. Published online 2012 Jan 25. doi: 10.1371/journal.pone.0030668

[5] Melanocortin 4 Receptor–Deficient Mice as a Novel Mouse Model of Nonalcoholic Steatohepatitis.Am J Pathol. 2011 Nov; 179(5): 2454–2463.doi: 10.1016/j.ajpath.2011.07.014

[6] Hepatocyte Transplantation into Diseased Mouse Liver. The American Journal of Pathology.Volume 157, Issue 6, December 2000, Pages 1963-1974

[7] Inflammation-induced IgA+ cells dismantle anti-liver cancer immunity.Nature. 2017 Nov 16;551(7680): 340-345.doi: 10.1038/nature24302. Epub 2017 Nov 8.

[8]Preclinical Models for Studying NASH-Driven HCC: How Useful Are They?Cell Metabolism.Volume 29, Issue 1, 8 January 2019, Pages 18-26

肝炎及肝脏疾病的研究需要建立和选择适当的动物模型，它们在阐明肝脏疾病的病理生理机制以及新药的开发中起着重要的作用。这里为大家介绍几种常见的肝脏疾病小鼠模型：

1.非酒精性脂肪性肝模型（饮食诱导及化学物质诱发等）

2.异种移植肝癌模型

3.自发肝癌小鼠模型

非酒精性脂肪性肝模型

非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）是常见的肝脏疾病之一，患者的脂肪在肝脏中过度累积，这种堆积不是由大量饮酒引起的；非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis, NASH）则是该疾病的亚型。NAFLD/NASH的临床前动物模型有饮食诱导、化学物质诱导等。可提供多种非酒精性脂肪肝小鼠模型及表型分析服务，同时也可根据实际情况定制研究人员需要的动物模型。

饮食诱导小鼠模型

给予动物高脂、高糖饲料喂养建立的脂肪肝模型，其主要发病机制是营养过剩，食物中脂类、胆固醇或糖类过量，无法完全吸收利用，脂类堆积于肝而引发脂肪肝，进一步出现肝炎性改变及纤维化。该模型与人类发病相似，是最常见的NAFLD动物模型。通过高脂高胆固醇高果糖饲料（GAN）喂养构建的NASH小鼠模型，可作为阐明非酒精性脂肪肝的病理生理机制以及新药的开发的动物模型。

使用GAN高脂高胆固醇高果糖饮食诱导的NASH模型的体重及血生化检测

结果显示：建模30周时，NASH组小鼠的体重、6h空腹血糖值、血清中ALT、AST和TC浓度均显著高于对照组。

使用GAN高脂高胆固醇高果糖饮食诱导的NASH模型的病理切片及NAS评分

结果显示：造模26周后，与对照组相比，NASH组小鼠的肝组织出现了明显的脂肪变性、气球样变与纤维化。此外，NASH组小鼠的NAS评分从造模后第16周开始，均达到了5分，与对照组差异显著，NASH小鼠造模成功。

化学物质诱发模型

四氯化碳（CCl4）可造成肝损伤，可单独施用或配合高脂饮食来诱发脂肪肝或肝纤维化。其机制主要是CCl4诱导肝脏发生氧化应激反应，导致有害的脂质和蛋白质过氧化产物不断产生和积累，并发生严重的坏死反应，从而导致肝细胞结构和功能破坏。

1.诱导肝纤维化和肝硬化

CCl4诱导的小鼠肝纤维化和肝硬化在许多方面反映了与毒性损伤相关的人类疾病模式，α-SMA表达、星状细胞活化和关键基质成分（包括胶原蛋白-1、基质金属蛋白酶及其抑制剂TIMPs）等已在该模型的发病机制中得到证实。CCl4诱导在肝脏中引起可重现的和可预测的纤维化反应，使其成为抗纤维化和抗肝硬化治疗的临床前药理学研究和肝纤维化-肝硬化-肝癌变化的病理生理学研究的宝贵基础。

WD和CCl4处理过的小鼠与人类NASH的组织学比较^[1]

2.诱导肝损伤

CCl4诱导肝损伤模型是一种广泛应用于肝脏病理研究的模型，其形态学和生化特征与人类肝脏疾病细胞病变相似。单剂量CCl4可导致中心部位坏死和脂肪变性，而长期给药可导致肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌（HCC）。研究人员构建了使用急慢性CCl4诱导的肝损伤模型并使用多种评估手段来评估新药与新疗法的疗效。

对照组与实验组的肝脏标本进行天狼星红染色^[2]

异种移植肝癌模型

异种移植肝癌模型是将不同种属来源的肿瘤细胞株移植到动物上所构建的模型，可分为异种皮下移植、原位移植等。其中，人源的异种皮下移植即把人源肿瘤细胞或组织移植于模型动物的腋窝、背部皮下等部位，这类方法有成瘤时间快、成模周期短、瘤体观察方便的优点，常用于筛选抗癌新药，是研究肿瘤细胞增殖以及体内筛选药物最常用的模型之一。

制备此类肝癌模型，可用肝癌细胞（如HuH7、Hep G2、NCI-H1299）接种到小鼠腋窝、背部皮下等部位进行建模，或者肿瘤组织先在免疫缺陷鼠皮下荷瘤，成功后再将肿瘤组织小块移植到小鼠的皮下进行建模。可为您提供多种小鼠皮下移植肝癌模型以及相应的药效学服务。

小鼠肝癌细胞Hep G2皮下移植肿瘤及体重生长曲线

自发肝癌小鼠模型

自发性肝癌模型是指实验动物未经人工处置，在人工创造的环境中所发生的肿瘤。这种模型最大的优点就是排除了人为因素的干扰，较好还原了动物模型在自然条件下的发病情况。构建的Alb-Cre+/MYC+小鼠模型，即可用于肝癌发生发展机制、药物筛选及疗效评价等相关研究。

Alb-Cre+/MYC+小鼠通过H11-CAG-LSL-hMYC-IRES-EGFP小鼠与Alb-Cre小鼠交配获得。MYC基因是一种原癌基因，其编码的核蛋白在细胞周期进程、细胞凋亡和细胞转化中发挥重要作用。Alb-Cre介导的重组导致H11-CAG-LSL-hMYC-IRES-EGFP小鼠的转录终止序列loxp-Stop-loxp缺失并在肝脏中过表达人源MYC原癌基因。该模型可自发肝癌，发病时间较早。

Alb-Cre+/MYC+小鼠生存曲线

实验结果显示，50%的Alb-Cre+/MYC+小鼠在6周龄左右发生死亡。

Alb-Cre+/MYC+小鼠肝脏瘤体观察

结果显示，与正常小鼠相比，3周龄Alb-Cre+/MYC+小鼠肝脏肿瘤较小，10周龄肿瘤明显增多且体积较大，发生明显的病变。

参考文献：

[1]Tsuchida, Takuma., Lee, Youngmin A., Fujiwara, Naoto., Ybanez, Maria.,  and Allen, Brittany.. "A simple diet- and chemical-induced murine NASH model with rapid progression of steatohepatitis, fibrosis and liver cancer." Journal of hepatology 69.2(2018):385-395.

[2]Scholten, D., Trebicka, J., Liedtke, C.,  and Weiskirchen, R.. "The carbon tetrachloride model in mice." Laboratory animals 49.1 Suppl(2015):4-11.

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种无酒精滥用的肝病综合征，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化和肝硬变。可从单纯性脂肪肝经非酒精性脂肪性肝炎（NASH）发展为肝纤维化，甚至导致肝硬化、肝细胞癌（HCC）或肝功能衰竭等终末期肝病。

 

 

一、模型动物的选择

常用的实验动物有大鼠、小鼠、家兔等，其中大鼠和小鼠的应用最为广泛，大鼠以 Wistar 和 Sprague Dawley（SD）为代表；小鼠的品系则更加多样，其中C57BL/6J 最常见。

二、模型构建方法

NASH模型主要有膳食动物模型【高脂饮食（high-fat diet, HFD）模型、蛋氨酸和胆碱缺乏（methionine-choline deficient, MCD）饮食模型、高胆固醇和高胆酸盐（high-cholesterol and high-cholate, HCh Ch）模型】、化学诱导模型（CCl4）诱发模型、乙硫氨酸诱发模型、高糖高脂饮食+链脲佐菌素（STZ）诱发模型】、基因修饰动物模型（DB/DB小鼠和OB/OB小鼠、Foz/Foz小鼠、SREBP-1c转基因小鼠）等。

下面将常用的NASH模型的建模方法进行总结梳理。

1、高脂饮食（HFD）模型

高脂高果糖高胆固醇饮食，模拟人类疾病形成机制，周期较长。

造模方法：

大、小鼠使用D09100301（起酥油版本）或者D09100310（棕榈油版本），动物不会很胖，造模周期14周左右，可用于NASH模型构建。

2、蛋氨酸限制、胆碱缺乏饮食，成模周期短，肝炎、肝纤维化。

造模方法：

1）MCD（蛋氨酸、胆碱缺乏饮食），MRCD（蛋氨酸微量、胆碱缺乏饮食），造模周期4-8周，实验动物状态较差、逐渐消瘦，甚至死亡；

2） HFMRCD（45%脂肪供能或60%脂肪供能基础，蛋氨酸微量、缺乏及胆碱缺乏饮食），造模周期4-6周，实验动物可有效保持体重，生存周期也会延长。

3、CCl）诱导

CCl4是最早采用的试验性脂肪肝模型诱导剂，可单独施用或配合高脂饮食来诱发脂肪肝或肝纤维化。

CCl4具有肝毒性，进入机体后在肝内产生活化氧自由基，过氧化作用增强，加快肝脂肪变性进程，损伤肝细胞，造成肝细胞变性坏死，引起细胞外基质（ECM）过度沉积而成肝纤维化，其代谢产物还可以刺激肝脏Kupffer细胞，释放促炎性细胞因子，进一步加重肝脏的损伤。

这种方法造模时间较短（8周左右），形成率高。适用于肝纤维化的研究。但是发病机制、病程变化及组织学形态与人类脂肪肝存在较大差异，并且CCl4具有较强的毒性，易致动物死亡。

4、四环素诱导

四环素属于抗生素类药物，具有肝毒性，可用于诱发动物脂肪肝。其主要通过干扰线粒体DNA复制或转录，抑制载脂蛋白合成并影响线粒体脂肪酸β-氧化，抑制肝脏极低密度脂蛋白的释放，脂质以脂滴形式聚于肝细胞内，继而造成肝细胞脂肪变性。

该模型造模时间短，费用低，药物毒性较CCl4弱，脂肪变性显著，适用于模拟某些环境因素所致的NAFLD研究，也具有CCl4类似的缺点。