推荐|肺癌症肿瘤荷瘤小鼠实验动物模型造模建立构建服务

肺癌是世界很多国家的高发病率和高死亡率的恶性肿瘤。2002年全世界的肺癌新病例大约为135万，死亡118万，居恶性肿瘤第一位。根据我国居民死因调查的结果，肺癌死亡率从20世纪70年代中期至90年代初期的20年间增加近1.5倍，是增长最快的恶性肿瘤。我国城市和农村的肺癌死亡率有明显差别，城市平均值高于农村，城市越大肺癌死亡率越高。我国30个市县肿瘤登记资料显示，1998～2002年肺癌的发病率为8.6～58.8。其中在恶性肿瘤分类统计中，肺癌居第1位的有14个市县，24个市县肺癌发病率大于30。按性别统计，男性肺癌发病率高于女性。因此，探索和发展肺癌的辨证论治的方法，揭示其疗效机制，有着迫切的需求。

如同所有人类疾病动物模型一样，肺癌肿瘤疾病实验动物模型的选择也应按依据其结构、功能代谢和人类尽量相似的实验动物，以达到充分模拟人类疾病的目的。目前，肺癌肿瘤疾病实验动物模型多选择小鼠、大鼠、地鼠、兔、犬和羊等，各种实验动物在肺癌研究中都各有特点。例如：小鼠的肺癌在组织、形态、分子特点上与人类肺癌比较相近，因为小鼠的进化过程与人类非常相似，与人类基因的同源性高，所以小鼠肺癌肿瘤疾病实验动物模型在研究中应用广泛。大鼠肺癌肿瘤疾病实验动物模型可采用支气管灌注肿瘤细胞悬液的方法或使用裸大鼠制备，由于大鼠支气管上皮的厚度与人类有明显差异，因而两者肺癌的诱发机制也可能不尽相同。地鼠(叙利亚金黄地鼠)适合于诱发肺癌，它无原发性肺癌，对诱发支气管性肺癌较敏感，肺癌诱发率较高。犬的原发性肺癌模型在影像学诊断、介入治疗与外科等方面与临床非常接近。羊的原发性肺癌发生率相对高，因此适合于进行肺癌的发病机制、发展病史以及对肺癌化疗等研究。

肺癌肿瘤疾病实验动物模型的分类包括：①动物自发肿瘤或是由致癌物诱发的肿瘤模型。常见的自发性肿瘤模型是近交鼠系的自发性肿瘤模型，它们自发形成肿瘤，且对化学致癌物易感，如甲基胆蒽(MCA)、煤焦沥青(CTP)、苯并芘(Bermopyrene)、二乙基亚硝胺(DEN)、焦油(tar)、香烟烟雾等。A/J和SWR是敏感性最高的鼠系。这一类动物模型常被用作肿瘤发生的研究。②移植肿瘤疾病实验动物模型。人类肿瘤(异种移植)或动物肿瘤同位或异位移植入宿主动物使宿主肿瘤形成。其宿主要求免疫抑制以防排斥反应，裸鼠、严重免疫缺陷鼠(SCID)均是常见的宿主。这类模型多用作新的治疗手段测试及筛查策略测试的工具。③基因改造动物模型。人们运用转基因技术将人肺癌中发现的癌基因导入鼠系或肺组织，或者运用基因敲除技术将抑癌基因敲除来制造肺癌模型。

为了验证中医药治疗肺癌的疗效，揭示其作用机制，开发更为有效的治法，中医工作者开展了大量的实验研究。研究中主要采用的是荷瘤小鼠。我们以往的实验研究发现，肺癌肿瘤疾病实验动物模型荷瘤小鼠会自发形成证候，存在证候的演变与兼夹。那么，近交系C57BL/6的Lewis肺癌肿瘤疾病实验动物模型荷瘤小鼠是否会出现类似证候与演变，我们开展了以下研究。

一、肺癌肿瘤疾病实验动物模型材料与方法

1．肺癌肿瘤疾病实验动物模型动物

肺癌肿瘤疾病实验动物模型采用6～7周龄的雄性C57BL/6小鼠30只，体重16～18g。

2．肺癌肿瘤疾病实验动物模型瘤源

肺癌瘤株。体外培养，Lewis肺癌细胞不出现接触生长抑制现象，增殖异常活跃。

3．肺癌肿瘤疾病实验动物模型构建主要仪器

同本章第一节中“H22肝癌荷瘤小鼠”的使用仪器。

4．肺癌肿瘤疾病实验动物模型造模建立方法

(1)肺癌肿瘤疾病实验动物模型荷瘤种鼠准备

(2)肺癌细胞准备

1)取接种第10～14日的肺癌肿瘤疾病实验动物模型荷瘤小鼠(种鼠)1只，脱颈椎处死。

2)将肺癌肿瘤疾病实验动物模型小鼠置于75％乙醇中浸泡1min。

3)取出肺癌肿瘤疾病实验动物模型小鼠，用高压灭菌手术剪解剖、分离肿瘤与肌肉组织，取下瘤块；置于无菌的培养皿中，并置于湿冰上。

4)移入细胞培养室内超净台上，剔除坏死组织、纤维包膜及血管；用无菌剪刀将瘤块剪碎(或用无菌玻璃杵子沿顺时针方向将瘤块碾碎)。

5)用0.9％生理盐水稀释细胞悬液，在150目筛网中过滤，弃去组织块。

6)吸取细胞悬液于10ml离心管中，1500r/min，离心5min。

7)弃去上清液。

8)吸取离心管底中上层的稠状细胞，置于新的离心管中。

9)用0.9％生理盐水10ml稀释细胞(即细胞母液)。

10)取20μl，再用0.9％生理盐水80μl稀释5倍。

11)再取1μl细胞液置于倒置显微镜下进行细胞计数。

12)依据细胞计数量，调整细胞母液至预接种细胞浓度(如1×10000000/ml)。

(3)Lewis肺癌小鼠模型建立

在实验动物中心，75％乙醇常规消毒小鼠右腋部，皮下注射0.2ml细胞液(含细胞数为2×1000000个)。每只肺癌肿瘤疾病实验动物模型小鼠接种前，充分摇匀细胞液，在30min内接种完毕。

5．肺癌肿瘤疾病实验动物模型指标检测

(1)四诊指标检测

同“H22肝癌荷瘤小鼠”。于第0日(接种肿瘤细胞前1日)、7日(接种肿瘤细胞第7日)、11日(接种肿瘤细胞第11日)、14日(接种肿瘤细胞第14日)、20日(接种肿瘤细胞第20日)各检测1次，共5次。

(2)特殊指标检测

按照公式计算：①瘤体积＝0.5×(最长直径×最短横径2)，单位为cm3。②去瘤体重＝带瘤体重－(瘤体积×1)。肺脏转移灶的肉眼观察与数码拍照。第21日处死各组小鼠。

6．数据处理

同本章第一节中“H22肝癌荷瘤小鼠”的数据处理。

7．统计分析

采用SPSS12.0统计软件，运用方差分析和t检验，P＜0.05表示在统计上具有显著性差异。

二、肺癌肿瘤疾病实验动物模型实验结果

1．正常与Lewis肺癌C57BL/6小鼠的外观

正常小鼠精神振奋、活跃喜探究、皮毛光泽，气血阴阳充盈；随荷瘤小鼠肿瘤日益增大，活动能力下降、站姿不稳、行走不便，气血阴阳耗损

2．成瘤情况

C57BIJ6小鼠接种Lewis肺癌细胞后7日，小鼠全部形成肿瘤，肿瘤形成率达100％。

3．存活情况

自第10日起，荷瘤小鼠出现自然死亡现象，不同时间荷瘤小鼠存活情况，见表4-2-1。

4．肺癌肿瘤疾病实验动物模型去瘤体重与瘤体积

Lewis肺癌荷瘤小鼠估算去瘤体重日益下降(见图4-2-7)，其中接种后第11日、14日、20日去瘤体重检测与正常组比较P＜0.05，提示出现典型的阴虚表现。Lewis肺癌实体瘤在C57小鼠上增长较快(图4-2-8)，尤其是在接种瘤细胞第2～3周肿瘤可增长至6g。

5．瘤体大体解剖照片(接种后第21日)

当小鼠处死后，解剖发现Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤体积与估算结果近似，见图4-2-9。

6．肺脏解剖照片(接种后第21日)

正常小鼠肺叶解剖洁净(图4-2-10)。Lewis肺癌小鼠可见大量的肺转移灶(图4-2-11)，转移灶呈球状或椭圆状，大小不等，色红，较坚硬。病理切片亦可见肿瘤转移灶(图4-2-12)。

7．证候变化及程度

(1)四诊表现

1)腋温。肺癌小鼠腋温自第14日起急剧下降，邪毒伤及阳气(图4-2-13)。

2)抓力。肺癌小鼠自肿瘤接种后，抓力便持续下降，气虚明显(图4-2-14)。

3)旷场水平跨格数。肺癌小鼠旷场水平跨格数自第7日起出现减少，邪毒耗伤正气(图4-2-15)。

4)旷场前肢离地数。肺癌小鼠旷场前肢离地数自第7日起出现减少，邪毒耗伤正气(图4-2-16)。

5)爪r值。肺癌小鼠爪r值自第7日起显著变小，爪色变淡，邪毒耗伤精血(图4-2-17)。

6)尾t值。肺癌小鼠尾r值总体上小于正常对照小鼠，但不似爪显著。这与C57小鼠尾巴色素沉着有关(图4-2-18)。

(2)气虚证

在肿瘤发展过程中，Lewis肺癌小鼠气虚程度十分严重，且日益加重，自第7日起，与正常组比较，P＜0.05(图4-2-19)。

(3)血虚证

在肿瘤发展过程中，Lewis肺癌小鼠出现典型的精血虚证，且日益加重，与正常组比较，P＜0.05(图4-2-20)。

(4)阴虚证

在肿瘤发展过程中，Lewis肺癌小鼠在疾病发生后出现阴虚证，且程度日益严重，自第11日起，与正常组比较，P＜0.05(图4-2-21)。

(5)阳虚证

在肿瘤发展过程中，Lewis肺癌小鼠出现阳虚证，且程度日益严重，与正常组比较，P＜0.05(图4-2-22)。

(6)同病异证

进一步对编号为F13和F16的Lewis肺癌小鼠各证候的演变进行分析：F13的Lewis肺癌小鼠接种前无气虚表现，接种肿瘤细胞后，气虚证日益显著，伴随阴虚证的发生与加重，而血虚、阳虚程度尚未形成(图4-2-23)。F16的Lewis肺癌小鼠接种肿瘤细胞后，气虚和阴虚证日益显著直至死亡，但血虚、阳虚证变化尚不明显(图4-2-24)。

三、讨论

1)中医药实验研究常用的是Lewis肺癌荷瘤C57 BL/6小鼠模型。研究表明：该模型稳定，皮下接种小鼠成瘤率几乎100％，肿瘤形成后小鼠自然生存期相对短，约3～4周，可用于中药药理学研究。

2)与H22肝癌荷瘤小鼠、SGC7901胃癌荷瘤裸鼠等相比，Lewis肺癌荷瘤小鼠易于发生肿瘤肺转移。因此，该模型还可用于中医药对肺癌转移与复发的实验研究。

3)从Lewis肺癌荷瘤小鼠疾病发生与发展分析，C57BL/6荷瘤小鼠与人类类似，存在着证候的自然发生与演变，可以模拟临床肿瘤证候的发生与演变，用于辨证论治的实验研究。与H22肝癌及其SGC7901胃癌荷瘤裸鼠相比，Lewis肺癌小鼠病情严重、发展快，其中早期邪毒壅盛证显著、中期呈现虚实夹杂的证候特征、晚期表现出气阴阳俱虚证。可能是Lewis肺癌荷瘤小鼠带瘤生存期短，C57BL/6 Lewis肺癌荷瘤小鼠同一阶段个体间的证候差异不大；而对于不同阶段而言，荷瘤小鼠的证候呈现日益加重的典型变化趋势，因而，有利于分期论治的实验探索。

一、常规实验动物模型操作外包技术服务

基本给药:大小鼠口服灌胃，皮下、肌肉、腹腔注射等。
常规取材:血、脑、心、肝、脾、肺、肾等:。
非常规取材:关节软骨，脑脊液，脊髓，神经节，骨髓等。

二、疾病实验动物模型造模诱导构建
(1)神经系统疾病实验动物模型
疾病实验动物模型 物种 实验动物模型构建方法

脑损伤疾病实验动物模型 大、小鼠          脑部手术
脑缺血疾病实验动物模型 大、小鼠 颈内动脉局部手术
帕金森疾病实验动物模型 大鼠 脑部手术
阿尔茨海默症老年性痴呆疾病实验动物模型 大、小鼠 化学方法
精神分裂症疾病实验动物模型 大、小鼠 化学方法
癫痫疾病实验动物模型 小鼠 化学方法
疼痛疾病实验动物模型 大、小鼠 物理，化学，神经结扎手术
脑脊髓炎EAE疾病实验动物模型 小鼠 化学诱导
抑郁疾病实验动物模型 大、小鼠 应激或化学试剂诱导
焦虑疾病实验动物模型 大、小鼠 应激
(2)心血管疾病实验动物模型
实验动物模型类型 物种 实验动物模型构建方法
动脉粥样硬化实验动物模型 大鼠、兔 高脂高胆固醇+维生素D喂养
主动脉粥样硬化实验动物模型 兔 高脂高胆固醇+主动脉球囊损伤
心肌缺血实验动物模型 大、小鼠 开胸手术
慢性心衰实验动物模型. 大鼠 阿霉素诱导
(3)消化系统疾病实验动物模型

疾病实验动物模型类型 物种 实验动物模型构建方法

非酒精性脂肪肝疾病实验动物模型 大、小鼠 化学方法
胰腺炎疾病实验动物模型 大、小鼠 精氨酸诱导
肝纤维化疾病实验动物模型 大、小鼠 化学方法
酒精性肝病疾病实验动物模型 大鼠 饲喂法
脂肪肝疾病实验动物模型 大、小鼠 饲喂法
急性肝衰竭疾病实验动物模型 小鼠 四氯化碳或对乙酰氨基酚
胆结石实验动物模型 豚鼠 饲喂法
(4)骨科疾病实验动物模型
疾病实验动物模型类型 物种 疾病实验动物模型构建方法
骨关节炎疾病实验动物模型 大、小鼠 叉韧带切除或碘乙酸化学损伤
类风湿关节炎疾病实验动物模型 大、小鼠 型胶原诱导
骨质疏松疾病实验动物模型 大、小鼠 造模方法较多，根据客户要求而定

(5)呼吸系统疾病实验动物模型
疾病实验动物模型类型 实验动物模型物种 实验动物模型构建方法
哮喘疾病实验动物模型 大、小鼠 物理方法与化学方法
慢性阻塞性肺病(COPD)实验动物模型 大、 小鼠 烟重加脂多糖注射
矽肺疾病实验动物模型 兔 手术造模
(6)其他疾病实验动物模型
疾病实验动物模型模型 物种 疾病实验动物模型构建方法
肥胖疾病实验动物模型 大、小鼠 高脂饲喂
急性尿毒症疾病实验动物模型 大、小鼠 切双侧肾脏
肾病疾病实验动物模型 大、小鼠 开腹手术或药物诱导
耳肿胀疾病实验动物模型 大、小鼠 二甲苯诱导
棉球肉芽肿疾病实验动物模型 大、小鼠 皮下植入灭菌棉球
静脉血栓疾病实验动物模型 大鼠 开腹手术
糖尿病疾病实验动物模型 大、小鼠 化学方法
裸鼠皮下荷瘤疾病实验动物模型 裸鼠 皮下荷瘤
多普勒B超小动物活体成像 大、小鼠

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