【分子生物医学实时荧光定量PCR扩增检测实验外包服务】

优质专业分子生物医学科研病理实时荧光定量PCR扩增检测鉴定实验外包服务

实时荧光定量PCR扩增检测实验外包服务即实时荧光定量PCR，就是在PCR的扩增过程中，通过荧光的信号，对PCR的进程进行实时的定性、定量检测，检测方式有SYBR Green染料法和Taqman探针法两种方式。

实时荧光定量PCR扩增检测实验外包服务探针法与染料法的优缺点

1. 探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，能够用多重体系反应的方法，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高，周期长。

2. 染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR产物的TM值，缺点就是特异性没有探针法好。

实时荧光定量PCR扩增检测实验外包服务实验周期及交付标准

1. SYBR Green染料法

实时荧光定量PCR扩增检测实验外包服务实验周期：1-2周

交付标准：扩增曲线、溶解曲线、Ct值、引物、实验报告（实验步骤、试剂、仪器等）

2. Taqman探针法

实时荧光定量PCR扩增检测实验外包服务实验周期：1个月左右

交付标准：拷贝数（绝对定量）、扩增曲线、标准曲线（绝对定量）、样品统计分析、探针及其序列实验报告（实验步骤、试剂、仪器、原始数据等）

实时荧光定量PCR扩增检测实验外包服务需确认的信息

1. 目的基因及种属

2. 样本种属及类型（组织、细胞、血清等）

3. 样本数量

4. 是否提供引物

5. 数据统计与分析要求

实时荧光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，荧光定量）技术（Real-time quantitative PCR），是指在（QPCR，荧光定量）反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号积累实时监测整个（QPCR，荧光定量）PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时荧光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，荧光定量）它具有特异性更强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法，目前（Real-time PCR，QPCR，荧光定量）在基因表达研究和临床疾病检测等领域已得到广泛应用（如转基因动植物检测、RNAi基因失活率检测、病原微生物或病毒含量检测、基因差异表达、基因分型）。本公司用Sybrgreen法或者Taqman法Real-time PCR，QPCR，荧光定量）对DNA/RNA 进行实时荧光定量PCR（Real-time PCR） 的定量测定或型的鉴定。
实时荧光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，荧光定量）分类：

☆TaqMan荧光探针（Real-time PCR，QPCR，荧光定量）
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5‘-3‘外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

☆SYBR Green荧光染料法：Real-time PCR|QPCR
SYBR Green是一种DNA结合染料，能非特异地掺入到双链DNA中去。在游离状态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链DNA中以后，便可以发出荧光。在Real-time PCR|QPCR实验中它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合，用于任意反应体系中。从经济角度考虑，它也比其它的探针的Real-time PCR|QPCR价格要便宜得多。但由于它能与所有的双链DNA结合，所以一旦反应体系中出现非特异扩增，那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性。要避免这种不利因素，可以通过选择良好的引物并优化反应条件以消除非特异性影响。

分子生物医学科研实时荧光定量PCR扩增检测实验外包服务客户提供
（1）Real-time PCR|QPCR基因信息
（2）Real-time PCR|QPCR实验前尽可能新鲜和足够量的组织（≧100mg）、细胞样品（10 ）或血清，或直接提供纯化好的总RAN（≧1ug）
历经10多年的发展，实时荧光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，荧光定量）已经由最初的简单定性发展到现在的Real-time PCR|QPCR，可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。技术的成熟，为其广泛的应用奠定了基础。
|实时荧光定量PCR|Real-time PCR|QPCR|服务内容
（1）根据Real-time PCR|QPCR目的基因设计引物及引物合成
（2）RNA抽提+逆转录
（3）RNA定量及质量分析
（4）使用荧光染料SYBR Green法进行Real-time PCR|QPCR（重复三次）
（5）数据处理
实时荧光定量PCR|Real-time PCR|QPCR的原始数据。扩增产物有良好的熔解曲线，可靠的重复性
②实时荧光定量PCR|Real-time PCR|QPCR 标准实验流程报告
③实时荧光定量PCR|Real-time PCR|QPCR实验结果检测报告。

●实时荧光定量PCR扩增检测实验外包服务主要实验步骤如下：

实时荧光定量PCR（Real-time PCR）是由三个步骤组成:
1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;
2.扩增:用PCR的方法扩增cDNA;
3.检测:实时检测和定量扩增的产物.

实时荧光定量PCR|Real-time PCR|QPCR中的一些术语

1 CT值：荧光信号有统计意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数，或者说是从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。

2 阈值：阈值的默认设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

3 CT值与起始模板的量成线性关系。